CRISPRシステムを使ったゲノム編集の概要 - CRISPRゲノム編集ツールの作成

CRISPRシステムの従来型では Cas9 タンパク質とガイドRNA (gRNA)の2つのコンポーネントを使います。 最も一般的に使用されるCas9は、化膿レンサ球菌 Streptococcus pyogenes から設計されたSpCas9 またはそれをヒトコドンに最適化したhCas9です。Cas9タンパク質はRNA誘導のDNAヌクレアーゼとしての機能をもち、特異的なターゲットサイトに二本鎖DNAの切断(double-stranded breaks : DSBs) を生じさせます。Cas9 バリアントもよく研究に用いられ、 “ニッケース” または Cas9(D10A)と呼ばれる機能としてはDNAに一本鎖切断を生じさせるCas９があります。仮にCas9ニッケースを、隣接する2種類のgRNAと組み合わせて使用すると、ニッケースは各相補鎖に一か所ずつ、合計2か所の1本鎖切断を生じさせ結果的にDSBが生じ、細胞は非相同末端結合(nonhomologous end-joining :NHEJ)経路を経て、DNA切断を修復します。これにより、通常小さなランダムな欠失、まれに挿入や塩基置換がおこります。これらの変異がタンパク質をコードする領域を破壊すると（例えば、フレームシフトを引き起こす欠失）機能的な遺伝子ノックアウトを発生させることができます。他の方法としては、CRISPRコンポーネントと同時に外来性ドナーDNAテンプレートを目的細胞に共導入し、相同性修復（ homology-directed repair ：HDR)を伴ったDSB修復を発生させます。この方法では、ターゲットゲノムDNAシークエンスがドナーDNAシークエンスで置換され、あらかじめドナーDNAシークエンスにデザインしていた点突然変異やノックインなどを人為的にターゲットサイトに導入します。ドナーDNAテンプレートは、一本鎖オリゴDNAヌクレオチド (ssODN) または dsDNAフラグメント (通常リニア化されたプラスミドDNA)で、ssODNsは点突然変異の導入またはエピトープタグや制限酵素サイトの人為的挿入に適しています。dsDNAフラグメントは大きな断片のノックインに広く使用されています。