# 概要説明
Extreme Genome Editing(EGE™)は、CRISPR/Cas9をベースに、Biocytogen社が独自に開発したゲノム編集技術です。DNA修復機構を非相同末端結合（NHEJ）から相同組み換え修復（HDR）へとシフトさせることで大きなフラグメントのノックイン効率を10～20倍向上させました。

EGE™システムはゲノム編集をさらに高速化し、迅速かつ正確にどの部位のゲノムのDNA 配列でも編集できるようにしました。ゲノム編集の効率が高まると、モデル生物の作製の成功率が上がりコスト節約になるほか、時間が短縮されるなど、様々なメリットがあります。

EGE™プラットフォームでは、ほぼどの遺伝子座においても高精度のDNA 編集が可能です。グローバルノックアウト(KO) ／ノックイン(KI）、コンディショナルノックアウト(cKO) ／ノックイン(cKI) 、 点突然変異、レポーターマウスなどの遺伝子改変マウスモデルを作製できます。


# CRISPRシステムを使ったゲノム編集の概要
CRISPRシステムの従来型では Cas9 タンパク質とガイドRNA (gRNA)の2つのコンポーネントを使います。 最も一般的に使用されるCas9は、化膿レンサ球菌 Streptococcus pyogenes から設計されたSpCas9 またはそれをヒトコドンに最適化したhCas9です。Cas9タンパク質はRNA誘導のDNAヌクレアーゼとしての機能をもち、特異的なターゲットサイトに二本鎖DNAの切断(double-stranded breaks : DSBs) を生じさせます。Cas9 バリアントもよく研究に用いられ、 “ニッケース” または Cas9(D10A)と呼ばれる機能としてはDNAに一本鎖切断を生じさせるCas９があります。仮にCas9ニッケースを、隣接する2種類のgRNAと組み合わせて使用すると、ニッケースは各相補鎖に一か所ずつ、合計2か所の1本鎖切断を生じさせ結果的にDSBが生じ、細胞は非相同末端結合(nonhomologous end-joining :NHEJ)経路を経て、DNA切断を修復します。これにより、通常小さなランダムな欠失、まれに挿入や塩基置換がおこります。これらの変異がタンパク質をコードする領域を破壊すると（例えば、フレームシフトを引き起こす欠失）機能的な遺伝子ノックアウトを発生させることができます。他の方法としては、CRISPRコンポーネントと同時に外来性ドナーDNAテンプレートを目的細胞に共導入し、相同性修復（ homology-directed repair ：HDR)を伴ったDSB修復を発生させます。この方法では、ターゲットゲノムDNAシークエンスがドナーDNAシークエンスで置換され、あらかじめドナーDNAシークエンスにデザインしていた点突然変異やノックインなどを人為的にターゲットサイトに導入します。ドナーDNAテンプレートは、一本鎖オリゴDNAヌクレオチド (ssODN) または dsDNAフラグメント (通常リニア化されたプラスミドDNA)で、ssODNsは点突然変異の導入またはエピトープタグや制限酵素サイトの人為的挿入に適しています。dsDNAフラグメントは大きな断片のノックインに広く使用されています。


# サービス概要
ゲノム編集用カスタムベクター作製サービスとは、標的部位に特異的なヌクレアーゼ（TAL Nuclease、NextGEN™ CRISPR、CRISPR/Cas 等）と、変異挿入用のドナーベクターをセットでカスタムに作製するサービスです。

ノックインやポイントミューテーション、コンディショナルノックアウトなど、様々なご要望に応じて最適なデザインをご提案・作製いたします。

また、CRISPR/Cas9 等の Site-Specific ヌクレアーゼと piggyBac™ トランスポゾンベクターを組み合わせることで、一旦組み込んだ配列を痕跡を残さずに（Footprint-free™）取り除く、ユニークなゲノム編集が可能です。

特に細胞でのポイントミューテーションでは、セレクションした後にセレクションカセットだけを除去し、必要な変異のみを残すことが可能で、目的細胞作製にかかる時間・労力を削減出来る利点があります。

その他、オプションで Off-Target のリスク予測も実施いたします。


# 幅広い遺伝子改変／細胞種をサポート
①遺伝子ノックアウト

＊標準の遺伝子ノックアウト

お客様が保有されている細胞株を追加費用不要でプロジェクトに組込むこともできます。

＊ダブル遺伝子ノックアウト

可能なオプション：2つ遺伝子のそれぞれのシングルノックアウトクローンの作製を含めることができます。

②遺伝子ノックイン

＊点変異ノックイン

可能なオプション：接合性要件を定義可能。

＊タグノックイン

タグ：His、FLAG、またはMyc

N末端、またはC末端の挿入位置へのノックイン

＊レポーターノックイン

レポーター：RFP、GFP、またはお客様により定義された蛍光レポーター

可能なオプション：HiBit、LgBit、またはNanoLUC挿入

N末端、またはC末端の挿入位置へのノックイン

③その他

＊iPSC編集

遺伝子ノックアウトおよび遺伝子ノックイン（SNP、タグ、レポーター）が可能

アルカリホスファターゼマーカー

分化サービスは取り扱っておりません。

＊複雑な遺伝子改変

Horizonは、様々な細胞株でほぼすべての遺伝子改変を実行するための蓄積された知識と専門性を保有しています。上記で記載されていない複雑な遺伝子改変については、お問い合わせください。

④Cas9発現細胞株

遺伝子改変プール細胞またはクローン細胞をお届けします。


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ゲノム編集サービス一覧